Direct Pulp Capping Using Biodentine

Introduction Direct pulp capping is therapeutic method of applying medication on exposed pulp in order to allow bridge formation and healing process. The aim of this study was to investigate the effect of Biodentine on exposed dental pulp of Vietnamese pigs. Material and Methods The study was conducted on 20 teeth of Vietnamese pigs (Sus scrofa domesticus). On buccal surfaces of incisors, canines and first premolars, class V cavities were prepared and pulp was exposed. In the experimental group (six incisors, two canines and two premolars) the perforation was covered with Biodentine® (Septodont, Saint-Maur-des-Fosses, France). In the control group, the perforation was covered with MTA® (Dentsply Tulsa Dental, Johnson City, TN, USA). All cavities were restored with glass ionomer cement (GC Fuji VIII, GC Corporation, Tokyo, Japan). Observation period was 28 days. After sacrificing the animals, histological preparations were done to analyze the presence of dentin bridge, an inflammatory reaction of the pulp, pulp tissue reorganization and the presence of bacteria. Results Dentin bridge was observed in all teeth (experimental and control groups). Inflammation of the pulp was mild to moderate in both groups. Neoangiogenesis and many odontoblast like cells responsible for dentin bridge formation were detected. Necrosis was not observed in any case, neither the presence of Gram-positive bacteria in the pulp. Conclusion Histological analysis indicated favorable therapeutic effects of Biodentine for direct pulp capping in teeth of Vietnamese pigs. Findings were similar with Biodentine and MTA.


INTRODUCTION
Direct pulp capping is therapeutic method of placing a medication on exposed pulp to induce formation of dentin bridge and healing.Preservation of pulp vitality is very important process, especially in young patients and in teeth with complicated multi canal systems [1,2].Numerous studies have confirmed calcium hydrox ide as gold standard for direct pulp capping since its introduction in dental practice in 1920 [2].High pH provides stimulating effect on odontoblasts that initiate production of tertiary dentin and pulp vitality preser vation.However, the success rate of calcium hydroxide as direct pulp capping medicament in published papers varies from 31% to 100% [36].Due to inadequate bond of calcium hydroxide with exposed pulp that degrades over time, porosity of new dentin bridge and appearance of internal resorption there is need to find more efficient material [3,7,8].
In the past twenty years, great attention was given to mineral trioxide aggregate ProRoot MTA® (Dentsply Tulsa Dental, Johnson City, TN, USA) for direct pulp capping and it was shown to induce complete dentin bridge for mation with no signs of pulp inflammation [9,10].MTA consists of tricalcium silicate, dicalcium silicate, tric alcium aluminate, calcium sulfate dihydrate, and bismuth oxide.Numerous studies have confirmed its biocompat ibility, antimicrobial effect, good sealing ability and good physical and chemical properties [11,12].It is hydrophilic and therefore can be used in wet operating field and the presence of blood.It was also confirmed that the thick ness of dentinal bridge increased after pulp capping using MTA as compared to calcium hydroxide [13,14,15].MTA shows excellent properties as material for direct pulp cap ping and successfully replaces calcium hydroxide because it does not cause local necrosis of the pulp, while chronic inflammation of the pulp rarely occurs [15].MTA causes functional and cytological changes in pulp cells as well as their transformation to odontoblast like cells which produce reparative dentin on the surface of the pulp [16,17].However, MTA has inferior antibacterial effect than calcium hydroxide, it is non stable as powder immediately after package opening, other disadvantages include high price on the market and long setting time: setting time of 10 minutes is specified by the manufacturer, a study of Torabinejad et al. [18] found setting time between 2 and 4 hours.
Contemporary research aimed to find a material for direct pulp capping that would have all good properties of MTA, but also to overcome its shortcomings.Biodentine® (Septodont, SaintMaurdesFosses, France) is a new generation material based on calcium silicate synthesized by bioactive technology.It is indicated as filling in all cases of damaged dentin, in the coronal part of root dentin, but can be also used for direct pulp capping.It consists of powder (tricalcium silicate, calcium carbonate and zinc oxide) and liquid (water, calcium chloride, modified polycarboxylate) and has setting time of 12 minutes [19].Biodentine stimulates release of TGFβ from pulpal cells, stimulating reparative dentin formation in a very short period of time.Using extracted human wis dom teeth, direct pulp capping using Biodentine showed good results in healing and pulp regeneration [20].Ex perimental study of Tran et al. [21] in rats showed similar effect of Biodentine and MTA in direct pulp capping in terms of creating dentin bridge (its thickness, continu ity, porosity), but significantly inferior performance was achieved with calcium hydroxide.Recent studies have also demonstrated favorable therapeutic results of Biodentine and MTA in direct pulp capping of primary teeth of pigs [22].Despite the fact that this new cement has already been used in dentistry as restorative material, its effect on the pulp tissue of humans has not yet been demon strated [22].
The aim of this study was to examine the effect of Bio dentine in direct pulp capping of exposed pulp in Viet namese pigs (Sus scrofa domesticus).

MATERIAL AND METHODS
The research was conducted at the Faculty of Veterinary Medicine, University of Belgrade, with the approval of the Ethics Committee of the School of Dental Medicine, Uni versity of Belgrade.The experiment included 20 teeth of Vietnamese pigs (Sus scrofa domesticus), aged 24 months and weight about 25 kg.The study procedure complied with the protocol of the European Good Laboratory Prac tice (86/609/EEC), which involved the implementation of main principles of asepsis and antisepsis, conducting the experiment in the minimum required time without physical and mental suffering of animals (International Organization for Standardization, 1997).ProRoot MTA® (Dentsply Tulsa Dental, Johnson City, TN, USA) was used as control material.

Experimental procedure
All animals were premedicated with atropine at the dose of 0.030.04mg/kg, and after 15 minutes they were intro duced to general anesthesia using xylazine in the dose 1.52 mg/kg and ketamine 2025 mg/kg intramuscularly.After rubber dam placement, the teeth were cleaned with 70% ethanol.On the buccal surfaces of incisors, canines and first premolars class V cavities were prepared using round carbide burs and continuous cooling with saline.Using a small round bur pulp chamber was exposed and bleeding controlled with sterile cotton pellet.Material was prepared according to the manufacturer's instructions and applied on the perforation.Teeth in the right quadrants of upper and lower jaw (6 incisors, two canines and 2 pre molars) received Biodentine.The same number of teeth in left quadrants of upper and lower jaw received MTA.All cavities were restored with glass ionomer cement (GC Fuji VIII, GC Corporation, Tokyo, Japan).Observational period was 28 days.
At the end of the procedure, the animals were given an analgesic dose of butorphanol in the dose of 0.10.2 mg/kg.After recovery the animals were kept in individ ual cages in breeding system.After 4 weeks animals were sacrificed after introducing general anesthesia and iv ad ministration of sodium phenobarbital in the dose of 100 mg/kg.The jaws were cut into block sections and tissue was fixed and prepared for microscopic analysis.

Histological procedure
Tissue for histological analysis was taken from every block of the experimental sample including the tooth and sur rounding bone.Samples were collected respecting the ISO criteria (Technical Report 7405) 28 days after the exposure of the pulp and direct capping.The material for histological analysis was fixed in 10% of formalin, decalci fied in 10% of formic acid (pH=5) and molded in paraffin.Serial sections were made in mesiodistal direction in the thickness of 4 µm.The samples were stained with hema toxylin and eosin, by method of Goldner and Gram (for the microscopic identification of bacteria) and analyzed using light microscope.
Histological criteria for the evaluation of pulp reaction were used by the methodology of Shayegan et al. [24].Formation of dentin bridge (A), morphological reorgan ization of pulp cells (B), inflammatory reaction of pulp (C) and presence of bacteria (D) were analyzed using the following scale: A) Dentin bridge (thickness, localization, structure, continuity with surrounding dentin): 0 -no dentin bridge 1 -incomplete presence of dentin bridge in the area of exposed pulp 2 -presence of lateral dentin bridge 3 -presence of dentin bridge which completely en closes exposed pulp; B) Morphological reorganization: 0 -normal pulp tissue 1 -disorganization of odontoblast like cells, odonto blast hyperactivity and proliferation of blood vessels be neath the exposed pulp 2 -complete disorganization of the pulp tissue 3 -pulp necrosis; C) Inflammatory reaction of the pulp (chronic or acute, intensity and localization of inflammation) -it was mon itored through the International Organization for Stan dardization and published criteria of Mjör [25] as: 0 -no inflammation or there are few inflammatory cells in the area of exposure 1 -mild inflammation and presence of inflammatory cells only at the site of exposure 2 -moderate inflammation with infiltration cells in the coronal and radicular pulp 3 -severe inflammation with cell infiltration which covers the entire pulp with complete disorganization of normal pulp tissue; D) The presence of bacteria: 0 -absence of bacteria in the pulp and dentinal tubules 1 -bacteria present in dentinal tubules, but not in the pulp 2 -bacteria present along the side walls of pulp chamber 3 -bacteria present in the whole pulp, along the side walls of the pulp chamber and dentinal tubules.

RESULTS
Histological analysis showed that dentin bridge was formed in all samples of the experimental and control groups (Table 1).Newly formed dentin had characteris tics of reparative dentin with or without small number of irregular dentinal tubules that were in continuity with surrounding dentin.Complete dentin bridge which closed pulp perforation was noted in 3 cases with Biodentine (Figure 1) and 4 cases with MTA (Figure 2).Odontoblast like cells associated with newly formed dentin were found below complete dentin bridge.The original odontoblasts were positioned peripherally.They are identified through their regular palisade arrangement, eosinophilic cyto plasm and basal nucleus alignment.
Incomplete dentin bridge in the form of dental islets was observed in 4 teeth in the group of Biodentine and 6 teeth in the group with MTA.Continuous reparative dentin that extends along the lateral walls of dentin was recorded in 3 cases in the group of Biodentine while this form of dentin was not registered in the samples with MTA.
Fully preserved pulp tissue was observed in only one case in the group of Biodentine and two cases with MTA.Pulp disorganization characterized by the appearance of odontoblast like cells and their hyperactivity was observed in most samples (8 teeth in the experimental and control Table 1.Histological analysis of dental pulp after application of the test materials Ta be la 1. Re zul ta ti hi sto lo ške ana li ze sta nja zub ne pul pe po sle pri me ne te sti ra nih ma te ri ja la   group), where in the central part of the pulp the presence of venous stasis, hemorrhage and inflammation was ob served (Figure 3).In most of these cases neoangiogenesis with prolif eration of existing and creation of new blood vessels was observed indicating healing process and complete revas cularization.Complete disorganization of the pulp tissue was registered in the samples of the experimental group, while it was not seen in samples of the control group (Fig ure 4).Necrosis was not observed in any case.
Histological analysis after 4 weeks revealed that the fol lowing experimental pulp capping material in most cases caused mild to moderate chronic inflammation of pulp tis sue (Figure 5).Severe inflammation or abscesses were not observed in any sample.Mild inflammation was present in 8 samples in the experimental group (Figure 6) and 7 samples in the control group with MTA (Figure 7).Moder ate inflammation where cellular proliferation was present both in coronal and radicular pulp was observed in 2 teeth of the Biodentine group and 3 teeth in the MTA group.
Gram staining showed the absence of gram positive bacteria in the pulp of all samples (Figure 7).Small num ber of bacteria in dentinal tubules was observed in 2 teeth with Biodentine and 3 teeth with MTA.

DISCUSSION
Previous studies with new materials were conducted on teeth of dogs [17,26], deciduous and permanent teeth of pigs [24,27] as well as monkeys [28].An important ad vantage in working with animals is that experiment can be carried out on large number of teeth in the same time period and the effect of various materials can be checked at the same time.
Results of the current study showed similar effects of Biodentine and MTA.The process of reparative dentino genesis and complete or partial closure of perforations with dentin bridge was considered as good therapeutic result.Dentin bridge was observed in all teeth where    perforations were capped using Biodentine.Similar re sults were confirmed by the study of Laurent et al. [20], where a favorable therapeutic effect of Biodentine was explained by significant release of TGFβ1 in pulp cells that stimulated odontoblasts to increase their activity and activate reparative dentinogenesis.Results of the current study where the pulp was capped by MTA also showed presence of dentin bridge in all samples which is con sistent with similar experimental study in pigs done by Shayegana et al. [24].
In most teeth of both groups, odontoblasts were ob served just below the dentin bridge with major or minor structural changes that ranged from mild to complete dis organization.It is likely that these cells are not true odon toblasts, but odontoblast like cells (although for definitive identification additional immunohistochemical analysis is required).These cells, similarly to true odontoblasts have elongated shape, palisade orientation and basal nucleus alignment [29].They have ability to produce extracellu lar matrix that after mineralization becomes complete or incomplete dentin bridge or islands that tend to establish contact with side dentin walls to close and preserve ex posed pulp.
In most of the samples in the MTA group reorgan ization of the tissue below the perforation was observed (hyperactivity of odontoblast like cells and altered cell morphology as compared to odontoblasts).This is also confirmed by the study of Tziafas et al. [17] performed on dogs.Correlation between the number of odontoblast like cells, the thickness of the bridge and preservation of deeper parts of the pulp was found.With increased num ber of these cells, the thickness of dentin bridge is increas ing and radicular part of the pulp remains vital [30].
In the group with MTA necrosis was not observed in any sample.In the experimental study of Tabarsi et al. [26] in dogs after direct capping with MTA necrosis was present in 22.7% of samples.Different findings of these two studies can be explained by the fact that in the study of Tabarsi et al.MTA was placed after pulpotomy was per formed whereas in the current study only small exposed surface of the pulp was covered with MTA.
In the group of Biodentine in most teeth mild inflam mation was observed, suggesting biocompatibility of the material [31].Acute inflammation and necrosis of the pulp was not observed in any of samples.This can be explained by good marginal seal achieved with glass ionomer cements and aseptic conditions as well as good immune status of ex perimental animals.The results of the current study dem onstrated the presence of inflammatory cells in the coronal and radicular part of the pulp.In the control group where pulp was capped with MTA only few samples showed the presence of lymphocytes, plasma cells and macrophages, which is consistent with the findings of other authors [24,26].Therapeutic effects were similar in the experimental and control groups, indicating that Biodentine has favorable effects on reparative activities of the pulp primarily due to their physical and chemical properties.
After application of both materials neoangiogenesis was observed, indicating regenerative processes in the pulp and successful tissue remodeling.Similar results obtained by both tested materials can be explained by similar chemical composition (dicalcium and tricalcium silicate make the most of the material).On the other hand Murray et al. suggested that for dentinogenesis the most important is preservation of pulp and odontoblasts, absence of infection and necrosis but not the type of material [29].

CONCLUSION
Reparation of pulp exposure was successful in the ex perimental and control group.In most teeth reparative dentinogenesis resulted in dentin bridge formation and preservation of functional and morphological integrity of the pulp.Histological analysis indicated favorable thera peutic effects of Biodentine which was similar to MTA after direct pulp capping of pulp in Vietnamese pigs.

KRATAK SADRŽAJ
Uvod Di rekt no pre kri va nje pul pe je te ra pij ski po stu pak pri me ne le ka na eks po ni ra nu pul pu zu ba ra di za tva ra nja pulp ne ko mo re i omo gu ća va nja pro ce sa za ra sta nja.Cilj ovog ra da je bio da se is pi ta efe kat bi o den ti na na eks po ni ra nu pul pu zu ba vi jet nam ske svi nje.Ma te ri jal i me to de ra da Is tra ži va nje je iz vr še no na 20 zu ba vi jet nam ske svi nje (Sus scro fa do me sti cus).Na ve sti bu lar nim po vr ši na ma se ku ti ća, oč nja ka i pr vih pre mo la ra ura đe ne su pre pa ra ci je ka vi te ta V kla se, pri če mu je na pra vlje na na mer na eks plo ra ci ja ko mora pul pe.U eks pe ri men tal noj gru pi (šest se ku ti ća, dva oč nja ka i dva pre mo la ra) per fo ra ci ja je pre kri va na pre pa ra tom Bi o den ti ne® (Sep to dont, Sent Mor de Fos, Fran cu ska).U kon trol noj gru pi per fo ra ci ja je pre kri va na sa MTA® (Dentsply Tul sa Den tal, Džon son Si ti, Te ne si, SAD).Svi ka vi te ti su re sta u ri ra ni gla sjo no mer-ce men tom (GC Fu ji VI II, GC Cor po ra tion, To kio, Ja pan).Op ser va ci o ni pe riod tra jao je 28 da na.Na kon žr tvo va nja ži vo ti nja na pra vlje ni su hi sto lo ški pre pa ra ti na ko ji ma su ana li zi ra ni po sto ja nje den tin skog mosti ća, in fla ma tor na re ak ci ja pul pe, re or ga ni za ci ja pulp nog tki va i pri su stvo bak te ri ja.Re zul ta ti Na svim zu bi ma eks pe ri men tal ne i kon trol ne gru pe za be le že no je stva ra nje den tin skog mo sti ća.Za pa lje nje pul pe je bilo bla go do ume re no i u eks pe ri men tal noj i u kon trol noj gru pi uzo ra ka.Uoče ni su zna ci neo an gi o ge ne ze i mno štvo će li ja slič nih odon to bla sti ma ko je su od go vor ne za stva ra nje den tin skog mo sti ća.Ne kro za ni je za be le že na ni u jed nom slu ča ju, kao ni pri su stvo Gram-po zi tiv nih bak te ri ja u pul pi.Za klju čak Hi sto lo ška ana li za je uka za la na po volj ne te ra pij ske efek te bi o den ti na u di rekt nom pre kri va nju pul pe zu ba vi jet nam skih svi nja.Re ak ci ja pul pe bi la je slič na oni ma ko je je iza zvao MTA.Ključ ne re či: di rekt no pre kri va nje pul pe; bi o den tin; MTA; den tin ski mo stić UVOD Di rekt no pre kri va nje pul pe je te ra pij ski po stu pak pri me ne le ka na eks po ni ra nu pul pu zu ba ra di za tva ra nja pulp ne ko mo re i omo gu ća va nja pro ce sa za ra sta nja.Oču va nje vi ta li te ta pul pe je iz u zet no zna ča jan po stu pak, po seb no kod ka ri je snih zu ba mla dih oso ba i zu ba s kom pli ko va nim vi še ka nal nim si ste mi ma [1,2].Broj na is tra ži va nja su po tvr di la da je kal ci jumhi drok sid tzv.zlat ni stan dard u di rekt nom pre kri va nju pul pe još od mo men ta nje go vog uvo đe nja u sto ma to lo šku prak su 1920.go di ne [2].Za to su od go vor ni vi so ka pH vred nost ovog pre pa ra ta i sti mu la tiv ni efe kat na odon to bla ste ko ji do vo di do stva ra nja ter ci jar nog den ti na i oču va nja vi ta li te ta pul pe.Ipak, pro ce nat uspe šno sti pri me ne kal ci jumhi drok si da u pu bli ko va nim ra do vi ma je ne u jed na čen -od 31% do 100% [36].Zbog neo d go va ra ju će ve ze kal ci jumhi drok si da sa eks po ni ra nom pul pom, de gra da ci je to kom vre me na, po ro zno sti no vo stvo re nog den tin skog mo sti ća i po ja ve in ter nih re sorp ci ja, po sto ji po tre ba za pro na la že njem efi ka sni jih ma te ri ja la [3,7,8].
Po sled njih dva de se tak go di na ve li ka pa žnja se po kla nja mi ne raltri ok sid agre ga tu Pro Ro ot MTA® (Dentsply Tul sa Den tal, Džon son Si ti, Te ne si, SAD), či ja je jed na od in di ka ci ja i di rekt no pre kri va nje pul pe, jer do vo di do stva ra nja kom plet nog den tin skog mo sti ća i bez zna ko va in fla ma ci je pul pe [9,10].MTA se sa sto ji od: tri kal ci jumsi li ka ta, di kal ci jumsi li ka ta, tri kal ci jum alu mi na ta, kal ci jumsul fa ta di hi dra ta i bi zmutok si da.Mno ge stu di je su po tvr di le nje go vu bi o kom pa ti bil nost, an ti mi krob ni efe kat, do bro zap ti va nje i do bre fi zič ke i he mij ske oso bi ne [11,12].Iz u zet no je hi dro fi lan i zbog to ga se mo že ko ri sti ti i u vla žnom ope ra tiv nom po lju i pri su stvu kr vi.Po tvr đe no je ta ko đe da je de blji na no vo stvo re nog den tin skog mo sti ća ve ća po sle pre kri va nja pul pe sa MTA ne go pri ko ri šće nju kal ci jumhi drok si da [13,14,15].MTA po ka zu je od lič ne oso bi ne kao ma te ri jal za di rekt no pre kri va nje zub ne pul pe i uspe šno za me nju je kal ci jumhi drok sid, jer ne pro u zro ku je lo kal nu ne kro zu pul pe, dok se hro nič no za pa lje nje zub ne pul pe re đe po ja vlju je [15].MTA iza zi va funk ci o nal ne i ci to lo ške pro me ne u će li ja ma pul pe, kao i nji ho vu tran sfor ma ci ju u će li je slič ne odon to bla sti ma, ko je iz gra đu ju fi bro den tin, od no sno re pa ra tiv ni den tin na po vr ši ni eks po ni ra ne pul pe [16,17].Me đu tim, MTA ima ma nji an ti bak te rij ski efe kat od kal ci jumhi drok si da, a ne do sta ci su mu ne sta bil nost pra ha ne po sred no na kon otva ra nja, vi so ka ce na na tr ži štu i du go vre me ve zi va nja: pro iz vo đač na vo di vre me ve zi va nja od 10 mi nu ta, a stu di ja To ra bi ne dža da (To ra bi ne jad) i sa rad ni ka [18] je utvr di la da je vre me ve zi va nja iz me đu dva i če ti ri sa ta.Cilj ak tu el nih is tra ži va nja je pro na la že nje ma te ri ja la za di rekt no pre kri va nje pul pe zu ba ko ji bi za dr žao sve do bre oso bi ne MTA, ali i pre va zi šao nje go ve ma ne.
Bi o den ti ne® (Sep to dont, Sent Mor de Fos, Fran cu ska) je ma te ri jal no vi je ge ne ra ci je na ba zi kal ci jumsi li ka ta ko ji je sin te ti san bi o ak tiv nom teh no lo gi jom.In di ko van je kao is pun u svim slu ča je vi ma ošte će nog den ti na, ka ko u kru nič nom, ta ko i u ko ren skom de lu zu ba, ali se mo že ko ri sti ti i za di rekt no pre kri va nje pul pe.Sa sto ji se od pra ha (tri kal ci jumsi li kat, kal ci jumkar bo nat i cinkok sid) i teč no sti (vo da, kal ci jumhlo rid, mo di fi ko va ni po li kar bok si lat) i ima vre me ve zi va nja od 12 minuta [19].Bi o den tin sti mu li še oslo ba đa nje TGFβ iz pulp nih će li ja, što do vo di do stva ra nja re pa ra tiv nog den ti na u vr lo krat kom vre men skom roku.Na mo de lu hu ma nih eks tra ho va nih tre ćih mo la ra di rekt no pre kri va nje pul pe bi o den ti nom po ka za lo je do bre re zul ta te u za ra sta nju i re ge ne ra ci ji pul pe [20].Eks pe ri men tal na stu di ja Tra na (Tran) i sa rad ni ka [21] na pa co vi ma po ka za la je sli čan efe kat MTA i bi o den ti na na re ge ne ra ci ju pul pe na kon di rekt nog pre kri va nja pul pe u po gle du stva ra nja den tin skog mo sti ća (nje go ve de blji ne, kon ti nu i ra no sti, po ro zno sti), ali i znat no sla bi je re zul ta te dej stva kal ci jumhi drok si da.No vi ja is tra ži va nja su ta ko đe po ka za la po volj ne te ra pij ske re zul ta te bi o den ti na i MTA kod di rekt nog pre kri va nja pul pe mleč nih zu ba svi nja [22].Upr kos či nje ni ci da se ovaj no vi ce ment već uve li ko ko ri sti u sto ma to lo gi ji kao re sta u ra tiv ni ma te ri jal, nje gov efe kat na pulp no tki vo lju di još ni je do ka zan [22].
Cilj ra da je bio da se pro ve ri efe kat bi o den ti na na eks po ni ra nu pul pu zu ba vi jet nam skih svi nja (Sus scro fa do me sti cus).

MATERIJAL I METODE RADA
Eks pe ri men tal no is tra ži va nje oba vlje no je na Fa kul te tu ve te ri nar ske me di ci ne Uni ver zi te ta u Be o gra du uz sa gla snost Etič kog ko mi te ta Sto ma to lo škog fa kul te ta Uni ver zi te ta u Be o gra du.U eks pe ri ment je bi lo uklju če no 20 zu ba vi jet nam ske svi nje (Sus scro fa do me sti cus) sta ro sti od 24 me se ca i te le sne ma se od 25 kg.To kom ra da po što van je pro to kol Evrop ske do bre la bo ra to rij ske prak se (86/609/EEC), ko ji pod ra zu me va pri me nu glav nih prin ci pa asep se i an ti sep se, re a li za ci ju eks pe ri men ta u mi ni mal nom po treb nom vre me nu bez fi zič kog i du šev nog bo la ži vo ti nja (Me đu na rod na or ga ni za ci ja za stan dar di za ci ju, 1997).

Eksperimentalni postupak
Kod ži vo ti nje je iz vr še na pre me di ka ci ja atro pi nom u do zi 0,03-0,04 mg/kg i.m., a na kon 15 mi nu ta ži vo ti nja je uve de na u op štu ane ste zi ju da va njem ksi la zi na u do zi 1,5-2 mg/kg i.m. i ke ta mi na u do zi 20-25 mg/kg i.m.Na kon ane ste zi ra nja i po sta vlja nja ko fer damgu me ra di izo la ci je, zu bi su oči šće ni se dam de se to pro cent nim eta no lom.Na ve sti bu lar nim po vr ši na ma se ku ti ća, oč nja ka i pr vih pre mo la ra okru glim kar bid nim bo re rom ura đe na je pre pa ra ci ja ka vi te ta V kla se uz stal no hla đe nje fi zi o lo škim ras tvo rom.Po tom je ma lim okru glim bo re rom eks po ni ra na ko mo ra pul pe, a kr va re nje je kon tro li sa no ste ril nim ku gli ca ma va te.Za tim je na per fo ra ci ju apli ko van pret hod no pri pre mljen ma te ri jal pre ma uput stvu pro iz vo đa ča.Na zu bi ma de snog kva dran ta gor nje i do nje vi li ce (ukup no šest se ku ti ća, dva oč nja ka i dva pre mo la ra) pri me njen je bi o den tin.
Na istom bro ju zu ba u le vom kva dran tu gor nje i do nje vi li ce po sta vljen je kon trol ni ma te ri jal MTA.Svi ka vi te ti su re sta u ri ra ni gla sjo no merce men tom (GC Fu ji VI II, GC Cor po ra tion, To kio, Ja pan).Op ser va ci o ni pe riod tra jao je 28 da na.
Po sle pre stan ka dej stva ane ste zi je ži vo ti nji je dat anal ge tik bu tor fa nol u do zi 0,1-0,2 mg/kg, a na kon opo rav ka svi nja je ču va na i ga je na u in di vi du al nom ka ve zu u farm skim uslo vi ma.Po sle če ti ri ne de lje ži vo ti nja je žr tvo va na uvo đe njem u op štu ane ste zi ju i da va njem pen to bar bo tonna tri ju ma i.v.u do zi od 100 mg/kg.Vi li ce su ise če ne na blok sek ci je i tki vo je fik si ra no i pri pre ma no za mi kro skop sku ana li zu.

Histološki postupak
Tki vo za hi sto lo šku ana li zu uze to je u blo ku i sva ki uzo rak je sa dr žao eks pe ri men tal ni zub i okol nu kost.Uzor ci su pri ku plje ni po štu ju ći ISO kri te ri ju me (Tec hni cal Re port 7405) 28 da na na kon eks po ni ra nja pul pe i di rekt nog pre kri va nja.Ma te ri jal za hi sto lo šku ana li zu je fik si ran u de se to pro cent nom for ma li nu, de kal ci fi ko van u de se to pro cent noj mra vljoj ki se li ni (pH=5) i ka lu pljen u pa ra fi nu.Na sta kle nim plo či ca ma su na pra vlje ne se rij ske sek ci je u me zi o di stal nom sme ru de blji ne 4 µm.Pre pa ra ti su bo je ni he ma tok si lineozi nom me to dom po Gold ne ru (Gold ner) i me to dom po Gra mu (Gram) zbog mi kro skop ske iden ti fi ka ci je bak te ri ja.Ma te ri jal je ana li zi ran pod sve tlo snim mi kro sko pom.
Hi sto lo ški kri te ri ju mi za pro ce nu re ak ci je pul pe su ko ri šće ni u skla du s me to do lo gi jom Ša je ga na (Shayegan) i sa rad ni ka [24].Ana li zi ra ni su den tin ski mo stić (A), mor fo lo ška re or ga ni za ci ja će li ja pul pe (B), in fla ma tor na re ak ci ja pul pe (C) i pri su stvo bak te ri ja (D) pre ma sle de ćoj ska li: A) Den tin ski mo stić (de blji na, lo ka li za ci ja, struk tu ra, kon ti nu i tet s okol nim den ti nom): 0 -ne ma den tin skog mo sti ća 1 -ne pot pun den tin ski mo stić u pre de lu eks po ni ra ne pul pe 2 -la te ral ni den tin ski mo stić 3 -pot pu ni den tin ski mo stić ko ji u ce lo sti za tva ra eks po ni ra nu pul pu; B) Mor fo lo ška re or ga ni za ci ja: 0 -nor mal no pulp no tki vo 1 -dez or ga ni za ci ja će li ja slič nih odon to bla sti ma, hi pe rak tiv nost odon to bla sta i pro li fe ra ci ja krv nih su do va is pod eks po ni ra ne pul pe 2 -pot pu na dez or ga ni za ci ja pulp nog tki va 3 -ne kro za pul pe; C) In fla ma tor na re ak ci ja pul pe (hro nič na ili akut na, in ten zi tet i lo ka li za ci ja za pa lje nja) -pra će na je za hva lju ju ći Me đu na rod noj or ga ni za ci ji za stan dar di za ci ju (In ter na ti o nal Or ga ni za tion for Stan dar di za tion) i ob ja vlje nim kri te ri ju mi ma Mjo ra (Mjör) [25] iz 1983.go di ne: 0 -ne ma za pa lje nja ili po sto ji ne ko li ko će li ja za pa lje nja u pre de lu eks po ni ra ne pul pe 1 -bla go za pa lje nje i po sto ja nje će li ja za pa lje nja sa mo na me stu eks po ni ra ne pul pe 2 -ume re no za pa lje nje gde će lij ska in fil tra ci ja do se že ko ro nar nu pul pu i deo ra dik sne pul pe 3 -iz ra zi to za pa lje nje, gde će lij ska in fil tra ci ja za hva ta ce lu pul pu s pot pu nom dez or ga ni za ci jom nor mal nog pulp nog tki va; D) Pri su stvo bak te ri ja: 0 -ne ma bak te ri ja u pul pi i den tin skim ka na li ći ma 1 -bak te ri je u den tin skim ka na li ći ma, ali ih ne ma u pul pi 2 -bak te ri je duž boč nih zi do va pulp ne ko mo re 3 -bak te ri je u ce loj pul pi, duž boč nih zi do va pulp ne ko mo re i u den tin skim ka na li ći ma.

REZULTATI
Re zul ta ti hi sto lo ških ana li za su po ka za li da je den tin ski mo stić stvo ren kod svih uzo ra ka i u eks pe ri men tal noj i u kon trol noj gru pi (Ta be la 1).No vo stvo re ni den tin imao je od li ke re pa ra tiv nog den ti na bez ne pra vil no po sta vlje nih den tin skih ka na li ća ili s ma lim bro jem ova kvih ka na li ća, ko ji su bi li u kon ti nu i te tu s okol nim den ti nom.Kom ple tan den tin ski mo stić ko ji je pot pu no za tva rao pulp ni pro stor u pre de lu per fo ra ci je za be le žen je u tri uzor ka na ko ji ma je pri me njen bi o den tin (Sli ka 1) i u če ti ri kod ko jih je pri me njen MTA (Sli ka 2).Is pod pot pu nog den tin skog mo sti ća uoče ne su će li je slič ne odon to bla sti ma ko je su u ve zi s no vo na sta lim tu bu lar nim den ti nom.Ori gi nal ni odon to bla sti su bi li po zi ci o ni ra ni pe ri fer no.Oni su pre po zna ti za hva lju ju ći nji ho vom re gu lar nom pa li sad nom ras po re du, eozi no fil noj ci to pla zmi i ba zal no po sta vlje nim je drom.
Ne pot pun den tin ski mo stić u vi du den tin skih ostr va ca uočen je kod če ti ri zu ba u gru pi u ko joj je pri me njen bi o den tin i kod šest zu ba u gru pi gde je pri me njen MTA.Kon ti nu i ran re pa ra tiv ni den tin ko ji se pro sti re duž la te ral nih zi do va den ti na uočen je u tri uzor ka u gru pi zu ba kod ko jih je pri me njen bi o den tin, dok ta kav vid den ti na ni je za be le žen u uzor ci ma kon trol ne gru pe (MTA).
Pot pu no oču va no pulp no tki vo za be le že no je sa mo u jed nom uzor ku u gru pi u ko joj je pri me njen bi o den tin i u dva uzor ka na ko ji ma je pri me njen MTA.Dez or ga ni za ci ja pulp nog tki va u vi du po ja ve će li ja slič nih odon to bla sti ma i nji ho ve hi pe rak tiv no sti uoče na je kod naj ve ćeg bro ja uzo ra ka (po osam zu ba i u eks pe ri men tal noj i u kon trol noj gru pi), kod ko jih su u cen tral nom de lu pul pe uoče ni ven ska sta za, kr va re nje i za pa lje nje (Sli ka 3).
U ve ći ni ovih uzo ra ka uoče ni su zna ci neo an gi o ge ne ze s pro li fe ra ci jom po sto je ćih i stva ra njem no vih krv nih su do va, što je uka zi va lo na pro ces za ra sta nja i pot pu nu re va sku la ri za ci ju.Pot pu na dez or ga ni za ci ja pulp nog tki va uoče na je u jed nom uzor ku eks pe ri men tal ne gru pe, dok se to ni je mo glo vi de ti ni u jed nom uzor ku kon trol ne gru pe (Sli ka 4).Ne kro za ni je za be le že na ni u jed nom slu ča ju.
Re zul ta ti hi sto lo ških ana li za na kon če ti ri ne de lje po ka za li su da je po sle pre kri va nja pul pe eks pe ri men tal nim ma te ri ja lom u naj ve ćem bro ju uzo ra ka za be le že no bla go ili ume re no hro nič no za pa lje nje (Sli ka 5).Iz ra zi ta upa la sa mno štvom će li ja za pa lje nja i po ja va ap sce sa ni su za be le že ni ni u jed nom uzor ku.Bla go za pa lje nje je usta no vlje no u osam uzo ra ka eks pe ri men tal ne gru pe (Sli ka 6) i u se dam uzo ra ka gru pe sa MTA (Sli ka 7).Ume re no za pa lje nje kod ko je će lij ska in fil tra ci ja za hva ta ko ro nar nu i deo ra dik sne pul pe uoče no je kod dva zu ba iz gru pe u ko joj je pri me njen bi o den tin i kod tri zu ba iz gru pe gde je pre kri va nje vr še no sa MTA.
Bo je njem pre pa ra ta po Gra mu uočen je pot pu ni iz o sta nak Grampo zi tiv nih bak te ri ja u pul pi svih uzo ra ka (Sli ka 7).Naj ma nji broj bak te ri ja u den tin skim ka na li ći ma za be le žen je kod dva zu ba eks pe ri men tal ne gru pe, dok su u kon trol noj gru pi bak te ri je uoče ne u tri uzor ka.

DISKUSIJA
Do sa da šnje stu di je sa no vim ma te ri ja li ma vr še ne su na zu bi ma pa sa [17,26], mleč nim i stal nim zu bi ma svi nja [24,27], od no sno na zu bi ma maj mu na [28].Zna čaj na pred nost u ra du s eks pe ri men tal nim ži vo ti nja ma je u to me što se eks pe ri ment mo že re a li zo va ti na ve li kom bro ju zu ba i u istom vre men skom in ter va lu mo že pro ve ra va ti efe kat raz li či tih ma te ri ja la.
Re zul ta ti ove stu di je su po ka za li slič ne re zul ta te na zu bi ma u kon trol noj i eks pe ri men tal noj gru pi.Pro ces re pa ra tiv ne den ti no ge ne ze i pot pu no ili de li mič no za tva ra nje per fo ra ci o ne ra ne den tin skim mo sti ćem u ovom is tra ži va nju sma trao se do brim te ra pij skim re zul ta tom.
Kod svih zu ba kod ko jih je pul pa pre kri ve na bi o den ti nom uočen je den tin ski mo stić.Slič ne re zul ta te po tvr di la je i stu di ja Lo re na (La u rent) i sa rad ni ka [20], gde auto ri po vo ljan te ra pij ski efe kat bi o den ti na ob ja šnja va ju zna čaj nim po ve ća va njem oslo ba đa nja TGFβ1 iz će li ja pul pe, ko ji de lu je sti mu la tiv no na odon to bla ste i po ja ča va nji ho vu se kre tor nu ak tiv nost, od no sno re pa ra tiv nu den ti no ge ne zu.U kon trol noj gru pi, u ko joj je di rekt no na pul pu apli ko van MTA, ta ko đe je uočen den tin ski mo stić u svim uzor ci ma, što je u sa gla sno sti sa slič nom eks pe ri men tal nom stu di jom na svi nja ma Ša je ga na i sa rad ni ka [24].
U naj ve ćem bro ju zu ba obe gru pe na me stu eks po ni ra ne pul pe, is pod no vo stvo re nog den tin skog mo sti ća, uoče ni su odon to bla sti s ma njim ili ve ćim struk tur nim pro me na ma ko je su va ri ra le od vr lo bla gih do pot pu ne dez or ga ni za ci je.Ve ro vat no je da to za pra vo i ni su odon to bla sti, već će li je slič ne odon to bla sti ma (iako su za nji ho vu ko nač nu iden ti fi ka ci ju po treb ne do dat ne imu no hi sto he mij ske ana li ze).One, kao i pra vi odon to bla sti, ima ju iz du žen ob lik, pa li sad nu ori jen ta ci ju i ba zal no po sta vlje na je dra [29].Ima ju spo sob nost stva ra nja i lu če nja van će lij skog ma trik sa, či jom mi ne ra li za ci jom na sta je re pa ra tiv ni den tin u vi du pot pu nog ili ne pot pu nog den tin skog mo sti ća, od no sno ostr va ca ko ja te že da us po sta ve kon takt sa boč nim zi do vi ma den ti na i ta ko za tvo re i sa ču va ju eks po ni ra nu pul pu.
U naj ve ćem bro ju uzo ra ka iz gru pe MTA pri me će na je re or ga ni za ci ja tki va is pod per fo ra ci je u vi du hi pe rak tiv no sti će li ja slič nih odon to bla sti ma i iz me nje ne mor fo lo gi je će li ja u od no su na odon to bla ste.Ovo po tvr đu ju i re zul ta ti stu di je na psi ma Cja fa sa (Tzi a fas) i sa rad ni ka [17].Uoče na je i po ve za nost iz me đu bro ja će li ja slič nih odon to bla sti ma, de blji ne mo sti ća i oču va no sti du bljeg de la tki va pul pe.S po ve ća njem bro ja ovih će li ja ra ste de blji na den tin skog mo sti ća, pri če mu pul pa u ra dik snom de lu za dr ža va svoj fi zi o lo ški iz gled [30].
U gru pi zu ba na ko ji ma je pri me njen MTA ne kro za ni je uoče na ni u jed nom uzor ku.U eks pe ri men tal noj stu di ji na psi ma Ta bar si ja (Ta bar si) i sa rad ni ka [26], po sle di rekt nog pre kri va nja pul pe, ne kro za je uoče na u 22,7% uzo ra ka.Dru ga či ji na la zi se mo gu ob ja sni ti či nje ni com da je u njihovoj stu di ji ura đen po stu pak pul po to mi je i po sta vljen MTA, a ni je vr še no di rekt no pre kri va nje ma le po vr ši ne eks po ni ra ne pul pe kao u našoj stu di ji.
Pri me nom bi o den ti na kod naj ve ćeg bro ja zu ba utvr đe no je bla go za pa lje nje, što go vo ri u pri log bi o kom pa ti bil no sti ma te ri ja la [31].Akut no za pa lje nje i ne kro za pul pe ta ko đe ni su za pa že ni ni u jed nom is pi ti va nom uzor ku.To se mo že ob ja sni ti do brim rub nim za tva ra njem ka vi te ta gla sjo no merce men tom i asep tič nim uslo vi ma ra da, ali i do brim imu no lo škim sta njem eks pe ri men tal nih ži vo ti nja.
Re zul ta ti na še eks pe ri men tal ne stu di je su ot kri li će li je za pa lje nja i u ko ro nar nom i u ra dik snom de lu pul pe.Kod uzo ra ka kon trol ne gru pe, u ko joj je pri me njen MTA, u sa mo ne ko li ko uzo ra ka uoče ni su lim fo ci ti, pla zmo ci ti i ma kro fa gi, što je u sa gla sno sti s na la zi ma dru gih auto ra [24,26].Budući da je te ra pij ski efe kat bio vr lo sli čan u eks pe ri men tal noj i u kon trol noj gru pi, to uka zu je na či nje ni cu da i bi o den tin ima po volj no dej stvo na re pa ra tor ne ak tiv no sti pul pe zu ba vi jet nam skih svi nja za hva lju ju ći, pre sve ga, svo jim fi zič kim i he mij skim oso bi na ma.
Na kon pri me ne bi o den ti na i MTA do šlo je i do neo an gi o ge ne ze u pul pi, što uka zu je na re ge ne ra tiv ne pro ce se u pul pi i uspe šnu re mo de la ci ju tki va.Slič ni re zul ta ti do bi je ni pri me nom ovih ma te ri ja la mo gu se ob ja sni ti slič nim he mij skim sa sta vom, jer oba ma te ri ja la u naj ve ćem pro cen tu sa dr že di kal ci jum i tri kal ci jumsi li kat.Na rav no, o ovo me ima i dru ga či jih mi šlje nja.Ta ko Ma ri (Mur ray) i sa rad ni ci [29] sma tra ju da su za za po či nja nje pro ce sa den ti no ge ne ze naj va žni ji oču va nost pul pe i odon to bla sta, te ne po sto ja nje in fek ci je i ne kro ze, a ne vr sta ma te ri ja la.

ZAKLJUČAK
Re pa ra ci ja ve štač ki iza zva nih ošte će nja zu ba eks pe ri men tal nih ži vo ti nja u eks pe ri men tal noj i u kon trol noj gru pi bi la je vr lo efi ka sna.Kod ve ći ne zu ba pro ces re pa ra tiv ne den ti no ge ne ze je is pra ćen stva ra njem den tin skog mo sti ća i oču va njem funk ci o nal nog i mor fo lo škog in te gri te ta pul pe.Hi sto lo ška ana li za je uka za la na po volj ne te ra pij ske efek te bi o den ti na u di rekt nom pre kri va nju pul pe zu ba vi jet nam skih svi nja.Re ak ci ja pul pe bi la je slič na oni ma ko je je iza zvao MTA.

Figure 1 . 1 .
Figure 1.Dentin bridge in the area of perforation covered with Biodentine.Shown in the form of islands of mineralized tissue (green).Biodentine particles cover the entire surface of the defect (Goldner Trichrome, 40×).Sli ka 1. Den tin ski mo stić u pre de lu per fo ra ci je pul pe pre kri ve ne bi o den ti nom.Uoča va se den tin ski mo stić u ob li ku ostr va ca mi nera li zo va nog tki va (ze le no).Iz nad den tin skog mo sti ća vi de se par tiku le bi o den ti na ko je pre kri va ju ce lu po vr ši nu ošte će nja (Gold ner Tric hro me, 40×).

Figure 2 . 2 .
Figure 2. Complete closure of exposed pulp by newly formed dentin bridge after direct pulp capping using MTA.MTA particles incorporated in dentin bridge can be observed (HE, 40×).Sli ka 2. Pot pu no za tva ra nje eks po ni ra ne pul pe no vo stvo re nim dentin skim mo sti ćem na kon pre kri va nja sa MTA.Uoča va ju se par ti ku le MTA in kor po ri ra ne u den tin ski mo stić (HE, 40×).

Figure 3 . 3 .
Figure 3. Reorganization of the pulp tissue after covering with Biodentine.Odontoblast like cells that produce dentin bridge are present (HE, 40×).Sli ka 3. Re or ga ni za ci ja pulp nog tki va na kon pre kri va nja bi o den tinom.Uoča va ju se će li je slič ne odon to bla sti ma ko je stva ra ju dentin ski mo stić (HE, 40×).

Figure 7 .
Figure 7. Venous stasis in the pulp after covering with Biodentine and appearance of dilated blood vessels.No bacterial cells in the pulp (HE, 40×).Sli ka 7. Ven ska sta za u pul pi zu ba po sle pre kri va nja bi o den ti nom i di la ti ra ni krv ni su do vi, ali bez bak te rij skih će li ja u pul pi (HE, 40×).

Figure 4 .
Figure 4. Reparative dentin in the group treated with MTA.Dentin bridge is separated from surrounding dentin with clearly visible demarcation line.Pulp tissue beneath the dentin bridge has normal structure (Goldner Trichrome, 100×).Sli ka 4. Re pa ra tiv ni den tin u gru pi uzo ra ka tre ti ra nih sa MTA.Dentin ski mo stić je odvo jen od okol nog den ti na ja sno vi dlji vom demar ka ci o nom li ni jom.Pulp no tki vo is pod den tin skog mo sti ća je nor mal ne struk tu re (Gold ner Tric hro me, 100×).

Figure 5 .
Figure 5.In majority of samples in both groups inflammatory cell s were either absent or present in small numbers (HE, 40×).Sli ka 5. U ve ći ni uzo ra ka obe gru pe ni su uoče ne će li je za pa ljenj skog in fil tra ta ili je nji hov broj bio ve o ma ma li (HE, 40×).

Figure 6 .
Figure 6.Dilated blood vessels with signs of venous stasis after pulp capping with MTA.Inflammatory cells are present (HE, 100×).Sli ka 6. Di la ti ra ni krv ni su do vi sa zna ci ma ven ske sta ze po sle pre kriva nja pul pe sa MTA.Će li je za pa lje nja ne po sto je (HE, 100×).